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對scFv基因文庫及pHEN1噬菌體展示栽體的限制性消化

更新時間:2013-03-07點(diǎn)擊次數(shù):1599

[器材和試劑]
●NcoI和NotⅠ限制性酶以及廠商的緩沖液3(New England Biolabs)(NEB3緩沖液)
●100×乙酰化牛血清蛋白(BSA)(New England Biolabs,與NotⅠ一起提供)
●37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱器
●GelleClean試劑盒(Qbiogene,Inc.)
●pHENl DNAL8),氯化銫純化制備
●再擴(kuò)增的scFv基因文庫

[方法]
1,配制兩個100ul PCR反應(yīng)混合液來消化scFV文庫,其中1個用于VH-VκscFv文庫,另1個用于VH-Vλ scFv文庫,該混合液含有:
●scFV DNA(1~4ug),50ul
●水,33ul
●10×NEB 3緩沖液,10ul
●乙酰BSA(100×),1.0ul
●Nco工(10U/ul),3.0f11
●NoJ工(10U/ul),3.0ul
2.37℃孵育反應(yīng)液過夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置,防止水分蒸發(fā)。或者,可以按PCR反應(yīng)那樣加一層礦物油(Sigma)。
3.用1%瓊脂糖膠純化基因文庫,并用Geneclean試劑盒提取DNA。重懸產(chǎn)物于30ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中,與已知大小和濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品比較,測定DNA濃度。
4.消化4ug氯化銫純化的pHENl DNA以準(zhǔn)備載體,其過程*如上述消化scFv基因文庫的流程,但須將scFvDNA替換為質(zhì)粒DNA②。
5.用0.8%瓊脂糖膠純化已消化的載體DNA,再按處理scFv插入序列的方式,用Gene-clean自膠中提取載體片段。將產(chǎn)物重懸于30ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中,與已知大小和濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品比較,測定DNA濃度。

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